利用甘蔗糖蜜生產(chǎn)飼料酵母發(fā)酵條件的研究

    以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)生物量飼料酵母，通過單因素正交試驗設(shè)計，確定優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：溫度28℃，pH5.0.裝液量200ml/500ml，搖床轉(zhuǎn)速180r/min，培養(yǎng)時間84h。在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下酵母菌株的總蛋白質(zhì)含量可達(dá)到6.01g/L。
    關(guān)鍵詞:甘蔗糖蜜; 飼料酵母; 正交試驗設(shè)計; 發(fā)酵條件
    近年來，許多國家已將微生物發(fā)酵技術(shù)逐步應(yīng)用到飼料工業(yè)生產(chǎn)上。飼料酵母是利用工農(nóng)業(yè)廢棄物及副產(chǎn)品下腳料采用酵母菌株發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的一種蛋白質(zhì)飼料，是單細(xì)胞蛋白質(zhì)的主要產(chǎn)品，其蛋白質(zhì)含量為40%-60%，并含有多種動物必須氨基酸和維生素，是營養(yǎng)價值近于魚粉的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)飼料。甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的主要副產(chǎn)物，總糖分在50%左右，且含有維生素和微量元素等多種可利用成分。甘蔗糖蜜含有豐富的適宜酵母生長的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵生產(chǎn)酵母的良好原料。利用甘蔗糖蜜生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料酵母極具開發(fā)潛力，可減少糖蜜的污染，具有重要意義。本實驗通過單因素和正交試驗設(shè)計，研究以甘蔗糖蜜為碳源發(fā)酵生產(chǎn)高生物蛋白質(zhì)飼料酵母的培養(yǎng)條件優(yōu)化組合，為工業(yè)生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料酵母提供實驗依據(jù)。

　　1 材料與方法
　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株。啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)S906, 前期試驗初篩獲得, 本實驗室保存。

　　1.1.2 材料與試劑。麥芽汁參照諸葛健( 1997) 麥芽處理方法進(jìn)行配制處理; 甘蔗糖蜜, 參照酸化水解法進(jìn)行糖蜜預(yù)處理, 試劑均為國產(chǎn)分析純。

　　1.1.3 主要儀器。BACKMANJ2- 21 高速冷凍離心機(jī)( 美國Backman 公司) ; YP1200 型電子天平( 上海精科實業(yè)有限公司) ; 糖用錘度計( 浙江余姚儀表二廠) ; SPX- 250 型生化培養(yǎng)箱( 上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠) ; HQL300A 柜式恒溫冷凍搖床( 中國科學(xué)院武漢科學(xué)儀器廠) ; 101- 2- BS 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱( 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠) ; 320 pH Meter (Mettlertoledo 公司) ; UV- 1601 紫外分光光度計( 日本SHIMADZU 公司) 。

　　1.1.4 培養(yǎng)基。麥芽汁斜面培養(yǎng)基: 10 °Bx 麥芽汁, 瓊脂2 %。種子培養(yǎng)基: 10 °Bx 糖蜜, 硫酸銨0.1 %, 磷酸二氫鉀0.1 %, 七水硫酸鎂0.04 %, pH5。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基: 同種子培養(yǎng)基, pH 5.5。

　　1.2 方法

　　1.2.1 菌株活化。無菌條件下接一環(huán)保藏菌種至麥芽汁斜面培養(yǎng)基, 28 ℃培養(yǎng)48 h 復(fù)蘇菌種。

　　1.2.2 種子擴(kuò)大培養(yǎng)。取一環(huán)活化后的斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝液量20 mL/100 mL 的種子培養(yǎng)基,28℃、180 r/min 培養(yǎng)24 h。

　　1.2.3 搖瓶發(fā)酵。發(fā)酵培養(yǎng)基裝液量100 mL/500mL 三角瓶, 接種量10 %, 28 ℃、180 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。

　　1.2.4 細(xì)胞生物量測定。發(fā)酵液6000 r/min 離心15 min, 蒸餾水洗滌3 次, 收集菌體, 80 ℃烘干至恒重, 稱量并記錄數(shù)值。

　　1.2.5 細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定。酵母細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行測定。

　　1.2.6 總蛋白質(zhì)得率。不同菌株的生物量和細(xì)胞蛋白質(zhì)含量各不相同, 有的菌株生物量低而蛋白質(zhì)含量高, 而有的菌株生物量高蛋白質(zhì)含量卻不理想, 綜合考慮兩個因素, 以單位容積的發(fā)酵液收獲的菌體全部蛋白質(zhì)含量( 總蛋白質(zhì)得率) 為最終分析指標(biāo)。總蛋白質(zhì)得率( g/L) =細(xì)胞生物量( g/L) ×細(xì)胞蛋白質(zhì)含量(%)。

　　1.2.7 單因素試驗。選取糖蜜濃度、氮源、pH、溫度、接種量、搖床轉(zhuǎn)速、裝液量、培養(yǎng)時間等因素研究其對菌株總蛋白質(zhì)得率的影響。

　　1.2.8 正交試驗。根據(jù)單因素試驗結(jié)果, 選取對生產(chǎn)蛋白質(zhì)飼料酵母發(fā)酵條件影響較大的顯著因素設(shè)計正交試驗, 研究發(fā)酵條件的最佳優(yōu)化組合。

　　2 結(jié)果與分析
　　2.1 單因素試驗
　　2.1.1 糖蜜酸化水解液糖度對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖1。

　　由圖1可知, 當(dāng)糖度10°Bx 時, 總蛋白質(zhì)得率最高, 因此后繼試驗培養(yǎng)基糖度為10 °Bx。

　　2.1.2 最佳氮源選擇。
    在培養(yǎng)液中分別添加一定比例的硫酸銨、氯化銨、尿素、蛋白胨、酵母膏、草酸銨, 培養(yǎng)后收集菌體, 測定細(xì)胞生物量及蛋白質(zhì)含量后計算總蛋白質(zhì)得率, 結(jié)果見圖2，由圖可知, 以蛋白胨作為氮源時總蛋白質(zhì)得率最高, 后繼試驗均以蛋白胨作為氮源。

　　2.1.3 蛋白胨濃度對總蛋白質(zhì)得率的影響。
　　在確定碳源與氮源的基礎(chǔ)上, 試驗進(jìn)一步研究了不同濃度蛋白胨對菌株S906 細(xì)胞生物量和蛋白質(zhì)含量的影響, 結(jié)果見圖3。由圖3 可知, 過高的蛋白胨濃度對細(xì)胞生物量及蛋白質(zhì)含量有一定的抑制作用, 蛋白胨濃度為7 g/L 時, 菌體細(xì)胞生物量和蛋白質(zhì)含量最高。

　　2.1.4 裝液量對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖4。

　　由圖4 可知, 發(fā)酵的最佳裝液量為150 mL/500 mL, 此時總蛋白質(zhì)得率最高。

　　2.1.5 pH 對總蛋白質(zhì)得率的影響。
　　酵母菌適宜的pH 范圍是微酸性的, 為了確定菌株總蛋白質(zhì)得率的最佳pH 值, 選擇了起始pH 值低于7 的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行試驗, 結(jié)果見圖5。由圖5 可知, 在發(fā)酵培養(yǎng)液起始pH 值為5 時酵母菌株的總蛋白質(zhì)得率最高。

　　2.1.6 搖床轉(zhuǎn)速對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖6。

　　由圖6 可知, 在一定范圍內(nèi), 隨著的搖床轉(zhuǎn)速增大總蛋白質(zhì)得率也隨之增加, 當(dāng)轉(zhuǎn)速為200 r/min 時總蛋白質(zhì)得率達(dá)最高值, 此后又呈下降趨勢, 后繼試驗搖床轉(zhuǎn)速為200 r/min。

　　2.1.7 溫度對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖7。

　　由圖7 可知, 溫度對總蛋白質(zhì)得率的影響較為顯著, 當(dāng)溫度為28 ℃時總蛋白質(zhì)得率最高。

　　2.1.8 接種量對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖8。

　　由圖8 可知, 以不同接種量把種子培養(yǎng)液接入發(fā)酵培養(yǎng)液, 當(dāng)接種量為10 %時總蛋白質(zhì)得率
最高。

　　2.1.9 培養(yǎng)時間對總蛋白質(zhì)得率的影響。見圖9。

　　由圖9 可知, 隨著培養(yǎng)時間延長, 總蛋白質(zhì)得率逐漸增加, 72 h 后達(dá)最大值, 此后呈現(xiàn)下降趨勢, 這可能與培養(yǎng)液中養(yǎng)料耗盡, 細(xì)胞發(fā)生自溶有關(guān)。

　　2.2 正交試驗
　　根據(jù)單因素試驗結(jié)果, 選取培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液pH 值、轉(zhuǎn)速、裝液量及培養(yǎng)時間5個顯著影響因素設(shè)計正交試驗, 采用L16( 45)的正交設(shè)計( 見表1) , 結(jié)果見表2。

　　由表2 可知, RA>RB>RE>RD>RC, 即溫度對總蛋白質(zhì)得率的影響最為顯著, 然后依次為pH、發(fā)酵時間、裝液量, 最不顯著的因子為搖床轉(zhuǎn)速。其中菌株S906 的最佳發(fā)酵條件組合為A2B2C2D3E4,即溫度28 ℃, pH 5.0, 搖床轉(zhuǎn)速180 r/min, 裝液量200 mL/500 mL, 培養(yǎng)時間84 h。由于在試驗設(shè)計表沒有符合此發(fā)酵條件的方案, 所以按照上述得出的最佳發(fā)酵條件做追加試驗, 試驗重復(fù)3 次, 并與初始培養(yǎng)條件下菌株的總蛋白質(zhì)得率進(jìn)行對比。試驗結(jié)果表明, 初始培養(yǎng)條件和優(yōu)化培養(yǎng)條下菌株的總蛋白質(zhì)得率分別為4.19 g/L 和6.01 g/L,比優(yōu)化前提高43.4 %。

　　3 結(jié)  論
　　本試驗以初篩所得高蛋白質(zhì)得率啤酒酵母菌株S906 作為初發(fā)菌株, 以甘蔗糖蜜為唯一碳源, 發(fā)酵培養(yǎng)飼料酵母。通過單因素試驗和正交試驗設(shè)計, 得出發(fā)酵培養(yǎng)蛋白質(zhì)飼料酵母的最佳培養(yǎng)基組合為: 糖蜜濃度10°Bx, 氮源為蛋白胨, 其最適濃度為7 g/L, 培養(yǎng)基初始pH 5.0; 最佳發(fā)酵條件為: 溫度28 ℃, 搖床轉(zhuǎn)速180 r/min, 接種量10 %, 裝液量200 mL/500 mL, 培養(yǎng)時間84 h, 在此最優(yōu)培養(yǎng)條件下菌株S906 總蛋白質(zhì)得率達(dá)到6.01 g/L。試驗結(jié)果表明， 甘蔗糖蜜是發(fā)酵培養(yǎng)蛋白質(zhì)飼料酵母的良好原料。（本文搜集整理于網(wǎng)絡(luò)，如有侵權(quán)之處，請聯(lián)系我們刪除。）